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從今天起小編將會(huì)不定時(shí)像大家分享一些分子實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)技巧，之前我們有分享過(guò)關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)、RNA提取、qPCR常見(jiàn)問(wèn)題等內(nèi)容干干干干貨！為什么你提取的RNA總是被降解？師姐心血之作 | 成功培養(yǎng)細(xì)胞的技巧都在這里了；老司機(jī)帶你輕松玩轉(zhuǎn)qPCR，問(wèn)題、異常統(tǒng)統(tǒng)搞定！點(diǎn)擊鏈接即可跳轉(zhuǎn)至內(nèi)容，今天呢我們分享的主要內(nèi)容是關(guān)于石蠟切片相關(guān)實(shí)驗(yàn)的一些注意事項(xiàng)和技巧。
石蠟切片技術(shù)的發(fā)展方便了很多科研人員對(duì)樣本的需求，通過(guò)石蠟包埋的樣本可以保存數(shù)年，并且對(duì)保存環(huán)境要求不嚴(yán)格，這對(duì)于科研人員來(lái)說(shuō)是極大的便利。石蠟包埋的原理是新鮮的樣本組織，通過(guò)石蠟處理，將石蠟代替了組織中的水分，從而制成切片，并能良好的保存組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。石蠟切片前期制作較為復(fù)雜，包括取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋┉┉封片等步驟，較為繁瑣。
具體實(shí)驗(yàn)步驟：
取材
根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇相應(yīng)的樣本，及時(shí)放入盛有固定液體的標(biāo)本瓶中，組織要求新鮮，擱置時(shí)間過(guò)久則產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解變性，導(dǎo)致細(xì)胞自溶及細(xì)菌的滋生，而不能反映組織活體時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
固定
固定液的種類很多，其對(duì)組織的硬化收縮程度以及組織內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì)的作用各不相同。固定液的用量一般為材料的10~15倍或稍多，常規(guī)固定時(shí)間為12~48h（根據(jù)組織塊大小而定），固定能使組織硬化，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。
洗滌與脫水
固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會(huì)影響后期的染色效果，可以用流水沖洗數(shù)小時(shí)，使用酒精或就是混合液固定的材料，不需要洗滌，可直接進(jìn)入脫水環(huán)節(jié)，脫水是為了因?yàn)樗屯该鲃┎换ト?，用酒精脫水后可讓透明劑進(jìn)入組織，可用70%、85%、95%、100%濃度的乙醇進(jìn)行脫水，脫水時(shí)間根據(jù)組織快大小而定，一般1-2小時(shí)，如果不能及時(shí)進(jìn)行梯度脫水，要將組織放入70%的乙醇中保存。
透明
酒精和石蠟不互溶，用二甲苯替換出組織內(nèi)的酒精。用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑，可先用一半的無(wú)水乙醇和一半二甲苯混合液浸漬，在換成二甲苯兩次共40min~2h（根據(jù)組織塊大小而定）。
浸蠟與包埋
是為了讓石蠟浸入組織替代透明劑，起支持作用，以便包埋。將熔化蠟倒人包埋盒，用溫鑷子夾取組織塊放入盒的中央位置，待石蠟全部凝結(jié)變硬即可取出。
修切蠟塊
把包埋好的蠟塊用刀片修切成正方形或長(zhǎng)方形，注意勿太靠近組織，讓組織四周留有少許石蠟，蠟塊兩邊必須切成平行的直線，以免切下的蠟條彎曲。
固定蠟塊
取小木塊，用蠟鏟在酒精燈上加熱，使石蠟塊底面熔化一層粘于小木塊上，冷卻后裝在切片機(jī)上。
載玻片
取干凈的載玻片涂以甘油蛋白：以玻璃棒尖端稍取甘油蛋白一滴，輕輕滴于載玻片中央，常以洗凈的手指加以涂布，涂布的面不宜太廣，而以恰恰能夠貼附蠟片為度。甘油蛋白不能涂布過(guò)多，否則，會(huì)形成白膜，妨礙觀察。
切片
注意刀的傾角，切片厚度一般為5-8μm，用毛筆托住蠟帶，放在展片盒內(nèi)（水溫宜在48°C左右）展片，刀片的鋒利度與石蠟塊的軟硬直接影響切片質(zhì)量。
貼片
蠟帶受熱即自動(dòng)展開(kāi)，也可用撥針輕輕拉開(kāi)。待蠟片完全展平后，用濾紙吸去多余水分。注意切片和載玻片之間不能有氣泡，否則在展片時(shí)氣泡會(huì)擴(kuò)大，甚至致使切片破損、變形，影響組織觀察。
烤片
將貼片置人37~62℃恒溫干燥箱干燥12h。干燥后片子常溫、陰涼處保存待實(shí)驗(yàn)時(shí)用。
以上是關(guān)于石蠟切片的相關(guān)技術(shù)操作，其實(shí)在實(shí)驗(yàn)中，石蠟切片技術(shù)是不容易掌握的，經(jīng)常會(huì)由于一些未知的因素導(dǎo)致切片質(zhì)量差，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所以下面小編將在切片過(guò)程中常見(jiàn)的一些問(wèn)題及解決方法大致羅列一下，希望對(duì)大家的科研有所幫助。
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