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（篇幅較長，耐心讀，一定受益匪淺）
研究目的與意義：1974年首次發(fā)現(xiàn)m6A甲基化，它是一種RNA分子上的甲基化修飾，m6A修飾在哺乳動物細胞中是動態(tài)可逆的，類似于DNA和組蛋白修飾的另一種表觀遺傳調(diào)控，近年來m6A甲基化已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。通過諸多學(xué)者辛苦研究，結(jié)果表明在mRNA中發(fā)現(xiàn)的m6A修飾可以調(diào)節(jié)癌細胞的生命活動。另外我們知道EMT是上皮細胞獲得間充質(zhì)細胞特質(zhì)的一種重要現(xiàn)象，通過EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（例如Snail，Slug，Twist和Zeb）來抑制e-cadheri的表達促進癌細胞的轉(zhuǎn)移，此外，Snail是e-cadherin表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，近年來圍繞EMT的表觀遺傳調(diào)控因素做了諸多研究，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化及組蛋白修飾等均可參與腫瘤細胞EMT的發(fā)生發(fā)展，但mRNA修飾對腫瘤細胞EMT的影響尚未揭示。
一、癌細胞中EMT受mRNA的甲基化水平調(diào)控
以上所有這些數(shù)據(jù)表明用TGF-β處理的癌細胞正在進行EMT過程。
為了證明m6A在EMT過程中的作用，作者使用CRISPR / Cas9編輯系統(tǒng)，在HeLa細胞中敲低METTL3，形成 METTL3Mut/− HeLa細胞。下圖是METTL3在野生型及METTL3Mut/− HeLa細胞中的蛋白表達情況。
進一步通過LC-MS/MS分析，結(jié)果顯示，METTL3 Mut/− HeLa 細胞的m6A水平顯著低于野生型細胞，這也證實了METTL3作為mRNA的m6A具有介導(dǎo)催化作用。
這些數(shù)據(jù)表明METTL3的缺失可以抑制癌細胞EMT的發(fā)生；
進一步通過蛋白質(zhì)印跡分析顯示ALKBH5的過表達增加了E-Cad，同時降低了HeLa細胞中的MMP2和FN。
此外，在METTL3Mut/−HeLa和Mett13敲低的Huh7細胞中恢復(fù)了由TGF-β誘導(dǎo)的E-Cad下調(diào)和FN上調(diào)。
根據(jù)上述數(shù)據(jù)已經(jīng)知道METTL3的缺失可以抑制癌細胞EMT的發(fā)生，作者進一步研究了METTL3的臨床作用。TCGA數(shù)據(jù)顯示，METTL3在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。
在364名肝癌患者中，METTL3的表達與CDH1 mRNA呈負相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)與上述數(shù)據(jù)呈現(xiàn)結(jié)果一致 。
根據(jù)Bertero等的報道，TGF-β可通過Smad2 / 3與METTL3-METTL14- WTAP復(fù)合物之間的相互作用誘導(dǎo)人胚胎干細胞（hESCs）中的mRNA甲基化。通過使用Smad2 / 3抑制劑B431542（10μM）預(yù)處理HeLa細胞，然后用TGF-β進一步處理3天，通過LC-MS/MS測定總mRNA的m6A 與A的比例，來計算m6A在mRNA上整體的甲基化程度。發(fā)現(xiàn)Smad2/3抑制劑SB431542（SB）可以阻礙TGF-β誘導(dǎo)的HeLa細胞中m6A的上調(diào)。
二、EMT的細胞，m6A會調(diào)控其它基因的變化
總的來說，m6A-seq數(shù)據(jù)顯示m6A修飾發(fā)生在EMT期間與細胞連接，粘附和遷移相關(guān)的少數(shù)基因上。
為了驗證Sainl是參與m6A調(diào)節(jié)的癌細胞EMT的潛在靶點，作者通過在EMT期間鑒定84個EMT的相關(guān)基因和61 個m6A調(diào)節(jié)基因（大于2倍m6A變化），最終確定了四個重疊基因。分別為SANI1、CTGF、MSN、CTNNB1，在四種鑒定的基因中，Snail被認為是控制EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子。作者的數(shù)據(jù)證實Sainl mRNA被m6A修飾，并且在EMT進展期間在CDS和3'UTR區(qū)域中m6A的顯著富集，另外，作者通過RIP技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在EMT細胞中，m6A水平的Sainl-mRNA顯著增加，富集倍數(shù)與對照相比約為2.3倍。
接下來，作者研究了在HeLa細胞中敲低METTL3、以及過表達ALKBH5時Snail蛋白的表達情況，。在METTL3缺失和ALKBH5過表達的兩種情況下，作者觀察到HeLa和HepG2細胞中Snail蛋白水平的降低而ZEB1表達沒有變化。
為了證實m6A對Snail表達有作用，作者用TGF-β處理野生型和METTL3Mut /-HeLa細胞。結(jié)果顯示，在METTL3Mut /-HeLa細胞中，TGF-β誘導(dǎo)的Snail表達低于對照細胞，這表明m6A參與TGF-β誘導(dǎo)的癌細胞中Snail的表達。
四、m6A促進癌細胞中Snail mRNA的翻譯
用Act-D處理野生型和METTL3Mut /-HeLa細胞以阻斷轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示野生型細胞中pre-mRNA和mat-mRNA的半衰期顯著短于METTL3Mut /-HeLa 細胞。表明m6A修飾可能引發(fā)pre-mRNA的剪切和癌細胞中Snail mat-mRNA的降解。
另外作者補充證實，Snail是YTHDF2的靶標，其負責(zé)m6A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物的mRNA去穩(wěn)定化。過量表達YTHDF2可降低HeLa細胞中成熟Snail mRNA的表達和穩(wěn)定性；
此外，作者用MG132預(yù)處理METTL3Mut /-HeLa細胞以抑制蛋白體外酶活性和使用CHX阻斷蛋白翻譯，然后用TGF-β處理。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，在CHX而非MG132存在下， TGF-β誘導(dǎo)的METTL3Mut /-HeLa細胞中的Snail表達減弱。
隨后作者將Snail CDS連接到多克隆位點（MCS）構(gòu)建了pmirGLO-Snail熒光素酶報告基因。 雙熒光素酶測定顯示，Snail在METTL3Mut /-HeLa細胞中的翻譯效率顯著低于野生型細胞。
下面作者對RNA進行分類，通過多聚核糖體分析，發(fā)現(xiàn)METTL3Mut /-HeLa細胞中80S的核糖單體和多聚核糖體都低于野生型細胞。
表明在EMT過程促進SNAI1 mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯。
作者通過對m6A-RIP測序，數(shù)據(jù)顯示CDS區(qū)域中m6A峰值位于第20條染色體上，48,600,490 to 48,600,630且在3 'UTR。
作者鑒定了3個GGAC motif，分別位于CDS區(qū)域和Snail mRNA的3'UTR區(qū)域；
下面作者對m6A甲基化對SNAI13'UTR及CDS區(qū)域分別作了詳細研究。
這表明3'UTR上的m6A甲基化可能不參與m6A修飾調(diào)節(jié)的Snail表達；
數(shù)據(jù)顯示，在過量表達pcDNA-Snail-CDS-mut1的METTL3Mut細胞中部分上調(diào)了Snail表達水平（上圖）。將pcDNA-Snail-CDS-WT、pcDNA-Snail CDS-mut1 / mut2轉(zhuǎn)染的HeLa細胞進行TGF-β處理。 蛋白印跡結(jié)果顯示，TGF-β誘導(dǎo)的pcDNA Snail-CDS-mut1的Snail表達低于pcDNA-Snail-CDS-WT和pcDNA-Snail-CDS-mut2（下圖）。
總之，結(jié)果數(shù)據(jù)表明SNAI1 CDS區(qū)域中的m6A是表達調(diào)控的主要位置；
由于真核生物的翻譯延伸是由兩個延伸因子作用進行的，：eEF-1和eEF-2，作者觀察了MetE13Mut -HeLa細胞中eEF-1和eEF-2結(jié)合Snail mRNA的變異。數(shù)據(jù)顯示，在METTL3Mut-HeLa細胞中Snail mRNA和eEF-2之間的結(jié)合顯著低于HeLa細胞中的結(jié)合。 此外，通過蛋白定性分析表明，得到了類似的結(jié)果。
六、m6A與癌細胞發(fā)展有關(guān)
這表明Snail參與了METTL3的體內(nèi)轉(zhuǎn)移作用。
