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近日，Nature子刊 Cell Death & Differentiation先后在線發(fā)表了兩篇circRNA相關研究論文：
本篇文章的通訊作者是青島大學轉化醫(yī)學院發(fā)育心臟病學中心主任王昆教授，介紹發(fā)現心肌缺血再灌注模型中一種自噬相關circRNA（ACR）能夠通過結合Dnmt3b抑制Pink1基因的甲基化，促進Pink1的表達，Pink1可促進FAM65B的磷酸化并抑制自噬的進程，在心肌缺血再灌注損傷過程中保護細胞[1]。
本篇文章的通訊作者是華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院童強松和鄭麗端。本文介紹AGO2基因內含子來源的circRNA（circAGO2）可結合HuR并促進其在靶基因3’UTR富集，阻止AGO2復合物結合，促進了靶基因的穩(wěn)定性，促進腫瘤進程[2]。
下面讓我們分別學習一下兩篇文章的故事吧：
ACR 參與自噬調控
自噬是重要的細胞生理活動過程，circRNA與自噬的關系之前已有相關報道，包括東南大學姚紅紅教授分別于2017年8月份和12月份發(fā)表于Autophagy雜志的兩篇文章，分別介紹了circHIPK2/miR-124-2HG/SIGMAR1軸通過調控自噬和ER Stress通路調控星形膠質細胞活化作用[3]，circRNA HECW2/miR-30D調控ATG5和Notch1通路[4]。在本篇文章中，作者通過芯片法分析了心肌缺血再灌注（I/R）后小鼠心肌circRNA表達差異，發(fā)現mmu_circRNA_006636在I/R后顯著下調，作者將其命名為自噬相關circRNA（Autophagy related circular RNA, ACR）
進一步，作者通過RNase R處理前后QPCR證明ACR的環(huán)形結構，過表達ACR等實驗證明ACR過表達可抑制細胞自噬過程。
圖1 ACR與細胞自噬有關 （引自[1]）
缺氧/復氧（A/R）處理后ACR的表達會顯著下降，過表達ACR后A/R處理導致的LC3聚集斑點有所減少，LC3-II也比對照組有所下降，說明過表達ACR可抑制自噬過程。電子顯微鏡分析后也表明過表達ACR后由A/R處理誘導的自噬小泡數量減少。
圖2 過表達ACR抑制自噬 （引自[1]）
敲低ACR后進行轉錄組芯片分析，探索與ACR相關的下游通路分子。結果表明在敲降ACR后，Pink1和Irgm1顯著下降，QPCR和Western也驗證了這一變化。但過表達ACR后Pink1增加的非常明顯，Irgm1變化不顯著。因此將ACR相關的通路鎖定在對Pink1的調控作用上。
圖3 ACR調控分子分析 （引自[1]）
作者發(fā)現Pink1的啟動子存在CpG甲基化區(qū)域，因此懷疑Pink1的表達是通過啟動子甲基化狀態(tài)調控的。DNA甲基化抑制劑5-Aza處理后能顯著增加Pink1的表達，進一步佐證了這個機制。通過抗Dnmt1，Dnmt3a，Dnmt3b的抗體分別RIP實驗，表明只有Dnmt3b能夠富集ACR。靶向ACR的探針Pull-down也能夠特異性富集Dnmt3b。敲降ACR后Pull-down實驗中Dnmt3b的富集減弱。Dnmt3b是否可以靶向Pink1的啟動子并調控其表達呢？通過ChIP實驗證明，Dnmt3b可以靶向結合Pink1的啟動子，敲降ACR后結合變強。干擾Dnmt3b能夠增加Pink1蛋白水平。A/R和I/R處理后靶向Pink1的Dnmt3b顯著增多。這些實驗表明ACR通過結合Dnmt3b，抑制其與Pink1啟動子的結合。
圖4 ACR通過Dnmt3b調控Pink1啟動子甲基化狀態(tài) （引自[1]）
進一步，作者在體外和體內證明了Pink1調控自噬通路。為了找到Pink1調控自噬過程的機制，作者利用CoIP后Western鑒定的方法證明Pink1與FAM65B相互作用?；谫|譜分析和抗體驗證，證明S46是Pink1靶向FAM65B的位點
圖5 Pink1靶向調控FAM65B的磷酸化 （引自[1]）
本文的工作比較細致嚴謹，環(huán)環(huán)相扣，一步步證明了ACR與Dnmt3b相互作用，抑制后者結合Pink1的啟動子。在缺氧/復氧或心肌缺血再灌注條件下維持細胞內Pink1的水平，抑制自噬通路的過度激活。本文的機制屬于競爭性結合蛋白的“protein sponge”模型，值得廣大同行學習借鑒。
circAGO2參與RNA穩(wěn)定性調控
AGO2是RISC復合物中唯一具有內切核酸酶活性的亞基成分，發(fā)現在多種腫瘤中呈現異常高表達的狀態(tài)。在這篇文章中作者發(fā)現了來自AGO2內含子的一種circRNA（circAGO2）能夠結合HuR蛋白，促進HuR在靶基因的3’UTR富集，阻止AGO2的結合，調控靶基因的穩(wěn)定性。
circBase數據庫中AGO2基因來源的circRNA共有6種，在胃癌AGS中能檢測到其中的兩種，其中一種（hsa_circ_0135889）在前列腺癌和結腸癌和胃癌組織中明顯高于癌旁組織，將其命名為circAGO2。Sanger測序鑒定其序列，FISH分析亞細胞定位表明circAGO2主要定位于細胞質中。常見的細胞系中進行Northern實驗表明在腫瘤細胞中存在明顯的circAGO2高表達，其分子量也與預期一致。
圖6 circAGO2鑒定 （引自[2]）
MKN-5細胞中過表達及AGS中干擾circAGO2表明circAGO2的表達與細胞侵襲明顯相關。皮下成瘤實驗也表明高表達circAGO2后MKN-5成瘤增強，干擾circAGO2后AGS細胞成瘤減弱。尾靜脈注射兩種細胞也證明circAGO2表達與腫瘤遷移密切有關。
圖7 circAGO2促進腫瘤遷移 （引自[2]）
Pull-down實驗分析與circAGO2互作的蛋白分子，質譜分析找到767種circAGO2互作的蛋白分子，結合數據庫檢索RBP蛋白及已知的AGO2結合蛋白，鎖定了四種潛在的互作蛋白：TARDBP, RPL27A,RBM4和HuR。但進一步的Pull-down驗證表明只有HuR能夠特異性的在circAGO2探針捕獲分子中富集。電泳遷移率改變分析（EMSA），GST融合標簽Pull-down， FISH共定位分析也證明了circAGO2與HuR相互作用。
圖8 circAGO2與HuR相互作用分析 （引自[2]）
CoIP實驗證明HuR與AGO2有相互作用。過表達和干擾circAGO2后轉錄組分析結合CLIPdb數據庫的信息，表明有132種基因3’UTR存在AU-rich的序列（ARE）。miRWalk工具分析了這些ARE附近的結合miRNA，RIP分析表明HuR與AGO2均可與這些基因的3’UTR結合，過表達circAGO2促進HuR與靶基因的結合，但同時會抑制AGO2的結合。結合干擾HuR，過表達miRNAs。在多種細胞中驗證了這一現象。
圖9 circAGO2調控HuR與AGO2的功能 （引自[2]）
作者還進一步分析了穩(wěn)定干擾circAGO2對成瘤能力的影響。基于HuR與circAGO2相互作用的分子模擬，設計了可阻斷該相互作用的小肽HIP-13，實驗表明該多肽能有效競爭性結合內源circAGO2，阻礙其與HuR的結合并抑制腫瘤遷移作用。
本文的故事豐富了我們對AGO2調控靶基因的機制的認識，也證明了circRNA是一類重要的功能分子，對探索circRNA的機制和功能提供了很有價值的借鑒。
參考文獻：
1. Lu-Yu Zhou, M.Z., Yan Huang, Sheng Xu, Tao An, Yun-Hong Wang, Rong-Cheng Zhang, Cui-Yun Liu, Yan-Han Dong, Man Wang, Li-Li Qian, Murugavel Ponnusamy, Yu-Hui Zhang, Jian Zhang, Kun Wang, The circular RNA ACR attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury by suppressing autophagy via modulation of the Pink1/FAM65B pathway. Cell Death & Differentiation, 2018.
2. Yajun Chen, F.Y., Erhu Fang, Wenjing Xiao, Hong Mei, Huanhuan Li, Dan Li, Huajie Song, Jianqun Wang, Mei Hong, Xiaojing Wang, Kai Huang, Liduan Zheng, Qiangsong Tong, Circular RNA circAGO2 drives cancer progression through facilitating HuR-repressed functions of AGO2-miRNA complexes. Cell Death & Differentiation, 2018.
3. Huang, R., et al., Circular RNA HIPK2 regulates astrocyte activation via cooperation of autophagy and ER stress by targeting MIR124-2HG. Autophagy, 2017: p. 0.
4. Yang, L., et al., Engagement of circular RNA HECW2 in the nonautophagic role of ATG5 implicated in the endothelial-mesenchymal transition. Autophagy, 2017: p. 1-70.
